Öğretim üyeliği görevinin yanı sıra araştırmalar da yapmaktaydı. 1885 yılında kutuplanmış bir geçirgen hareketinin, bir akımla aynı manyetik etkileri gösterdiğini açıkladı. 1890'lı yılların ortalarında çoğu araştırmacı gibi o da katot ışın tüplerinde oluşan lüminesans olayını incelemekteydi. "Crookes tüpü" adı verilen içi boş bir cam tüpün içine yerleştirilen iki elektrotdan (anot ve katot) oluşan bir deney düzeneği ile çalışıyordu. Katottan kopan elektronlar anoda ulaşamadan cama çarparak, floresan adı verilen ışık parlamaları meydana getirmekteydi. 8 Kasım 1895 günü deneyi biraz değiştirip tüpü siyah bir karton ile kapladı ve ışık geçirgenliğini anlayabilmek için odayı karartıp deneyi tekrarladı. Deney tüpünden 2 metre uzaklıkta baryumplatinocyanite sarılı olan kağıtta bir parlama fark etti. Deneyi tekrarladı ve her defasında aynı olayı gözlemledi. Bunu mat yüzeyden geçebilen yeni bir ışın olarak tanımladı ve matematikte bilinmeyeni simgeleyen X harfini kullanarak "X ışını" ismini verdi. Daha sonraları bu ışınlar, "Röntgen ışınları" olarak anılmaya başlanmıştır.

Bu buluşundan sonra Röntgen farklı kalınlıktaki malzemelerin ışını farklı şiddette geçirdiğini gözlemledi. Bunu anlamak için fotoğrafsal bir malzeme kullanıyordu. Tarihteki ilk tıbbi X ışını radyografisini de (Röntgen filmi) yine bu deneyleri sırasında gerçekleştirdi ve 28 Aralık 1895 yılında bu önemli keşfini resmi olarak duyurdu. Ancak X ışınını bulduğu zaman deneylerinde elini kullandığı için aşırı dozda X ışınından parmaklarını kaybetti.

Olayın fiziksel açıklaması 1912 yılına kadar net olarak yapılamasa da, buluş fizik ve tıp alanında büyük heyecan ile karşılandı. Çoğu bilim adamı bu buluşu modern fiziğin başlangıcı saydı.